Новый твердофазный иммуносорбент в терапии больных вульгарной пузырчаткой

Вульгарная пузырчатка — тяжёлый аутоиммунный дерматоз. В настоящее время базисными препаратами в терапии пузырчатки являются системные глюкокортикостероиды, а при стероидорезистентных тяжёлых формах пузырчатки используются адъювантные методы терапии. Наиболее эффективным и безопасным считается иммуносорбция. Т. В. Абрамова и соавторы в своей экспериментальной статье освещают разработку нового твердофазного иммуносорбента на основе агарозной матрицы Affigel 15 и рекомбинантного десмоглеина 3 типа человека в качестве лиганда для селективного удаления аутоантител из сыворотки крови больных вульгарной пузырчаткой.

Сегодня известно несколько десятков аутоиммунных заболеваний, в патогенезе которых ведущая роль принадлежит реакции иммунной системы к собственным антигенам. Пузырчатка — одно из тяжёлых аутоиммунных буллезных заболеваний, которое характеризуется поражением кожи и/или слизистых оболочек. Основными антигенами аутоагрессии при пузырчатке являются трансмембранные гликопротеины десмосом — десмоглеины 3 и 1 типов (Dsg3 и Dsg1) [1–3]. У больных пузырчаткой вырабатываются аутоантитела — иммуноглобулины класса G (IgG). Различают разные клинические формы пузырчатки: вульгарную и листовидную [4–6]. Появление в сыворотке крови аутоантител к Dsg3 [7, 9] считается ключевым фактором, способствующим развитию клинического фенотипа вульгарной пузырчатки [9].

В настоящее время лечение пузырчатки направлено на подавление синтеза и элиминацию аутоантител к белкам кератиноцитов. Базисными препаратами являются системные глюкокортикостероиды (ГКС), однако их длительное использование может привести к развитию тяжёлых осложнений, отягощающих состояние больных и ухудшающих прогноз заболевания [10, 11]. Авторы подчёркивают, что актуальными остаются вопросы терапии при тяжёлых и стероидорезистентных формах заболевания. С целью снижения высоких доз системных ГКС назначают адъювантную терапию (цитостатики, экстракорпоральные методы), но количество осложнений остаётся высоким. К тому же иммуносупрессивные препараты усугубляют уже имеющееся иммунодефицитное состояние больных [5, 6, 12, 13].

Наиболее эффективной и безопасной считается иммуносорбция, основанная на удалении аутоантител из крови больных с помощью иммуносорбентов. Используют три вида сорбентов. Неселективные, с низкой и с высокой степенью селективности (декстрансульфат, триптофан, фенилаланинсодержащие и др.), которые способны сорбировать такие компоненты плазмы крови, как фибриноген, альбумин, липиды, иммуноглобулины. Сорбенты с низкой селективностью (с иммобилизованным стафилококковым белком А) имеют сродство к определённой фракции белков плазмы. Однако использование неселективных и малоселективных иммуносорбентов приводит к элиминации не только патогенетически значимых аутоантител, но и иных иммуноглобулинов и иммунных комплексов, необходимых для полноценного функционирования иммунной системы, что ограничивает их применение [14–19]. К наиболее безопасным методам лечения аутоиммунных заболеваний относится экстракорпоральный метод с использованием специфических иммуносорбентов, обладающих высокой степенью селективности, которые извлекают только определённые белки без изменения концентрации других компонентов плазмы пациента [19].

Авторы отмечают, что существующие в настоящее время иммуносорбенты не обладают селективностью, их использование увеличивает риск развития инфекционных заболеваний. В связи с этим актуально создание сорбентов, селективно элиминирующих антитела к десмоглеину 3 типа (Dsg3) из сыворотки крови пациентов с пузырчаткой.

Т. В. Абрамова и соавторы разработали иммуносорбент на основе агарозной матрицы Affigel 15 и рекомбинантного десмоглеина 3 типа человека в качестве лиганда. Эксперименты in vivо и in vitrо показали, что созданный иммуносорбент способен направленно элиминировать аутоантитела класса G к десмоглеину 3 типа. Полученные результаты позволяют заключить, что синтезированный селективный иммуносорбент Affigel 15 — Dsg3 обладает совокупностью свойств, предопределяющих перспективность разработки твердофазных матриц и их применения в терапии больных вульгарной пузырчаткой.

В ходе экспериментальной части авторы получили образцы периферической крови от 22 больных вульгарной пузырчаткой (основная группа) с активностью 200 и более RU/мл и от 14 здоровых лиц (контрольная группа). Для индукции пузырчатки у лабораторных животных in vivo применяли IgG, выделенный из пула сывороток больных вульгарной пузырчаткой с активностью антител к Dsg3, равной 12000 RU/мл. Принимая во внимание сходный характер распределения десмоглеинов — основных антигенов при пузырчатке у неонатальных мышей и человека [20], для создания экспериментальной модели и последующей оценки эффективности сорбции аутоантител к Dsg3 in vivo были выбраны неонатальные самцы мышей инбредной линии BALB/c в возрасте до 24 ч от рождения со статусом SPF (specified pathogen free). В серии экспериментов проводили: клиническое наблюдение с определением эрозий и/или пузырей на кожных покровах мышей; получали аутопсийный материал (биоптаты кожи) мышей для последующего морфологического (выявление акантолиза) и иммуногистохимического (определение фиксированных IgG в коже) исследования.

Авторы отмечают, что экспериментально были получены данные, что сорбционная ёмкость селективного иммуносорбента составляет 3500 RU/мл и значительно превышает сорбционную ёмкость немодифицированной матрицы Affigel 15, равную 400–450 RU/мл. Таким образом, показана высокая сорбционная ёмкость полученного иммуносорбента для связывания аутоантител к Dsg3 человека из сыворотки крови больных вульгарной пузырчаткой. Также экспериментально была доказана стабильность синтезированного иммуносорбента и его пригодность для многократного использования.

Для определения эффективности иммуноадсорбции сравнивали развитие симптомов пузырчатки у лабораторных животных, которым вводили фракции IgG из пула сывороток крови больных (активность антител к Dsg3 12000 RU/мл) и этот же препарат после хроматографии на синтезированном иммуносорбенте. Остаточная активность после хроматографии составила 2600 RU/мл. В экспериментах in vivo использовали следующие препараты: № 1 — IgG с активностью 15000 RU/мл; № 2 — IgG с активностью 2600 RU/мл после взаимодействия с иммуносорбентом; № 3 — IgG, выделенный из пула сывороток крови здоровых лиц [21, 22]. Указанные препараты вводили четырём группам мышей (по 10 особей в каждой) интраперитонеально двукратно по 30 мкл c интервалом 24 ч: группа А — препарат № 1; группа Б — препарат № 2; группа В — препарат № 3; группа Г — стерильный фосфатно-солевой буферный раствор. Группы В и Г рассматривали как контрольные.

Развитие симптомов пузырчатки (клинические, морфологические, иммуногистохимические) во всех группах животных оценивали в течение 48 ч после последней инъекции. У мышей группы А после инъекций препарата № 1 наблюдались единичные эрозии в абдоминальной области, положительный симптом Никольского. При морфологическом исследовании аутопсийного материала кожи мышей выявлялся патогномоничный признак пузырчатки — супрабазальный акантолиз. При иммуногистохимическом исследовании криосрезов кожи мышей данной группы обнаружена выраженная фиксация IgG в межклеточных промежутках эпидермиса на большем его протяжении с формированием чёткой структуры «сетки».

У мышей группы Б введение препарата № 2, полученного от больных пузырчаткой, после взаимодействия с иммуносорбентом Affigel 15 — Dsg3, не приводило к появлению клинических и морфологических признаков пузырчатки. При исследовании аутопсийного материала мышей методом нРИФ наблюдалась диффузная фиксация IgG в межклеточных промежутках надбазальных слоёв эпидермиса без формирования чёткой структуры «сетки».

В контрольных группах лабораторных животных (В, Г) клинические, морфологические признаки пузырчатки не определялись. Проведение иммуногистохимического исследования аутопсийного материала мышей не выявило фиксации IgG в эпидермисе.

Авторы статьи пришли к выводу, что в экспериментах in vivo подтверждена эффективность использования селективного иммуносорбента Affigel 15 — Dsg3 для снижения активности аутоантител в сыворотках крови больных пузырчаткой. Применение иммуносорбента приводило к уменьшению содержания антител к Dsg3 в образцах сывороток крови больных пузырчаткой и предотвращало развитие клинических, патоморфологических, иммуногистохимических признаков заболевания у лабораторных животных.

Таким образом, на основе агарозной матрицы Affigel 15 и рекомбинантного Dsg3 человека в качестве лиганда синтезирован иммуносорбент Affigel 15 — Dsg3, позволяющий селективно удалять антитела (IgG) к структурному компоненту десмосом — десмоглеину 3 типа, играющему патогенетическую роль в развитии вульгарной пузырчатки. Сорбционная ёмкость полученного иммуносорбента составляет 3500 RU/мл при ёмкости немодифицированной матрицы Affigel 15, не превышающей 450 RU/мл. Созданный иммуносорбент характеризуется стабильностью, что делает его пригодным для многократного использования.

Авторы отмечают, что клиническая эффективность сорбента подтверждена в экспериментах in vivo: аутореактивные антитела к десмоглеину 3 типа после хроматографии на Affigel 15 — Dsg3 теряют способность индуцировать клинические, морфологические и иммуногистохимические признаки пузырчатки у лабораторных животных. Таким образом, синтезированный селективный иммуносорбент Affigel 15 — Dsg3 обладает совокупностью свойств, делающих его перспективным для разработки твердофазных матриц, применяемых в терапии больных вульгарной пузырчаткой.